3.4 PCR原位再生式序列复制反映
Zebe等1994年当先淡薄了原位再生式复制反映( Selfsustained sequence replication reaction， 简称3SR反映)。它可看成原位RTPCR的一种采用方法用于无缺的细胞和组织切片中低拷贝数mRNA的检测。
优点：故意于与免疫组织化学相王人集。4 植物原位 PCR 工夫的操作要领
植物原位 PCR 的基本要领包括标本制备、预处罚、原位扩增、后处罚和检测等。
4.1 标本制备
固定剂的采用和固定的时候、温度因材料标本不同而互异。但固定条目的笃定， 必须同期得志 2 个条目:①保捏染色体、细胞和组织标本阵势结构的无缺性;
②将原位门径中扩增遵循的示寂减到最小。
Tips：①关于DNA的原位 PCR， 交联型固定剂(福尔马林、4%多聚甲醛、中性甲醛)较为适应。交联型固定剂较利于卵白质和核酸彼此交联， 使扩增居品保留在原位，着重其向细胞外扩散或被洗脱。
②固定时的温度也会对甘休产生影响， 室温或 37℃固定24～48 h， 可获最强信号。
③标本的年齿对试验甘休影响也很大， 最佳接受簇新制备的不逾越1个月的染色体标本。用簇新固定的细胞作念原位 PCR， 要比归档的石蜡切片作念原位 PCR 敏锐得多。
4.2 预处罚 预处罚可增多细胞的通透性， 促使反映考剂投入细胞内， 并使待扩增的靶序列显现。在进行消化处罚时国产 av， 酶种类的采用、浓度、温度和处罚时候等条目的优化关于原位PCR都很伏击
Tips：①胃卵白酶、胰卵白酶或卵白酶K均可用于消化。推选使用胃卵白酶或胰卵白酶国产 av， 因为卵白酶K较难失活且易引起过度消化， 而胃卵白酶、胰卵白酶在以后的洗涤要领中， 可通过晋升pH遏制其活性， 或通过加热使其失活。
②酶处罚的方法取决于固定剂和标本类型。多聚甲醛和戊-二-醛固定的材料比FAA固定的材料需更长的酶处罚时候， 且具小液泡的组织比具大液泡的组织预处罚时候更长。
③组织切片的细胞仍具有细胞壁， 应进行适应的预处罚。
④关于解离好的染色体标本可不消进行卵白酶消化， 而关于解离不充分的染色体标本要高出着重消化过度或消化不及。消化过度则扩增的靶序列易丢失， 消化不及则不利反映液的投入， 二者均会导致假阴性的出现。
⑤随机候， 卵白酶消化之前还需进行一些其他处罚， 如进行卵白酶消化之前， 进行了果胶酶处罚。果胶酶处罚可去除非特异性物资的浑浊
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4.3 原位扩增
原位PCR扩增体系中， 各组分的浓度和反映温度、时候、轮回次数等的优化极为伏击。由于玻片和细胞卵白可能对反映液有所吸附， 因此， 与液相PCR比拟， 原位PCR扩增溶液中各组分浓度相对较高。
Tips：①液相PCR中最优的MgCl2浓度为1.5 mmol/L， 而原位PCR中为4.5 mmol/L;
②液相PCR中Taq DNA团员酶的旧例使用量为1.5 U， 而原位PCR要5 U才能产生较强的信号；
③反映温度因引物而定；
④轮回次数不宜过高， 一般为20～30。
⑤为了晋升特异性， 可接受多步轮回法或半套式扩增。
⑥为了笃定原位 PCR 检测的准确性， 必须树立阴性对照， 可树立为扩增反映液中不加入 Taq DNA团员酶或引物。
⑦蜿蜒法原位PCR反映液中的组分与野蛮PCR相同， 而平直原位PCR反映液中则包含了秀丽的引物或单核苷酸。在当今植物原位PCR的告喜讯说念中， 都接受DIG-11-dUTP单核苷酸秀丽， 但dTTP与DIG-11-dUTP的使用浓度、二者的比例
各不交流。dTTP 和DIG-11-dUTP的终浓度比是原位扩增顺利进行的一个要素， 比值太高会使得DIG-11-dUTP在扩增历程中失去竞争力， 比值太低可能使信号扩散， DIG-11-dUTP 的浓度太高会变成空间羁系。因此， 要优化出最适应的浓度和比例。
⑧反映液的体积应说明标本在玻片上的些许进行诊治， 挑选合适大小的原位克隆环EasiSeal， 以着重反映液溢出或笼罩不及。
⑨应说明不同植物材料、不同标本类型等各式成分， 优化出适应的原位PCR体系，才能取得理念念的甘休。
4.4 后处罚
大部分标本在原位扩增后要进行洗涤， 以缩小布景和保留强阳性信号。针对不同的标本过火检测方法， 后来处罚也有所不同。
Tips：①为晋升检测贤慧性和特异性， 使扩增居品保留在细胞内， 在洗涤完后， 用4%多聚甲醛或2%戊-二-醛对材料进行后固定， 可取得较好的后果。
②关于染色体标本， 高出是纤维素酶和果胶酶处罚较好的染色体标本， 其不似组织或细胞标本有细胞壁的保护， 扩增后的洗涤必须缩小强度， 不然很容易使扩增信号丢失。
③洗涤强度应说明检测信号进行优化， 若信号扩散可增多洗涤强度， 若出现假阴性， 则要缩小洗涤强度。
4.5 检测
当今， 使用非辐射性秀丽和检测DNA探针有生物素秀丽、地-高-辛秀丽和荧光素秀丽3 大检测系统。
Tips：①接受地-高-辛秀丽检测系统， 用 NBT/BCIP(硝基四唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)显色进行检测。
②接受 Anti-DIG-Fluorescein(荧光绿－地-高-辛抗体)进行免疫反映， 在显色反映中可采用DAPI (4，6-二脒基-2-苯基吲哚)或PI (碘化丙啶)， 或DAPI/PI， 采用合适的荧光引发块进行检测。
③原位PCR的检测系统可参考原位杂交的检测方法进行。
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